发布时间：2023-09-15 浏览次数：
ELISA实验原理及常见问题的解决方法
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是双抗体夹心法及间接法。
ELISA样本的处理
ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划。
注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2。
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融。
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色。
5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存。
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深。
反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存。
ELISA的常见标本
液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等
培养细胞
组织标本
ELISA标本的保存
一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，
浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
测抗体的血清的标本如需保存作多次检测，以少量分装冰存，
保存血清只采集是就应注意无菌操作，也可加入适当的防腐剂，抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议劲量不使用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
ELISA标本的处理
1、血清：室温血液私人凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如有沉淀形成，应再次离心
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成分时，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清，检测细胞内的成分时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分。
5.组织标本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后任然保持2-8°C的温度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用，
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行试验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20°C保存，单应避免反复冻融。
ELISA的常见问题及解决方法
高背景或阴性对照只偏高
可能原因：
1、阴性对照孔被阳性对照货样品污染 解决办法：洗涤时，勿将洗液溢出孔外
2、抗体非特异性结合 解决办法：封闭液不合适，更换封闭液
3、酶结合物过浓 解决办法：请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
4、孵育温度过高 解决办法：检查孵育箱的温度是否正确、稳定
5、底物再使用前曝光 解决办法：应保存再暗处、避光
6、读板前停留时间过长 解决办法：加终止液后3分钟内读数
标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因：
1、样本中无检测物或检测无含量极低 解决办法：设置内参，重新实验
2、样本中其它物质影响/掩盖检测 解决办法：作适当稀释，降低其它物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率
3、样本中检测物浓度过高，HOOK效应导致假低值 解决办法：适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内
重复性较差
可能原因：
1、微孔中有气泡 解决办法：用针尖挑破气泡
2、试剂未混匀 解决办法：确保充分混匀试剂
3、样本中有杂质或沉淀物 解决办法：使用前，离心
4、微孔包被面被吸头划破 解决办法：加液时小心操作
5、使用过的封板胶纸 解决办法：每次须使用新的封板胶封住反应孔
假阳性反应
可能原因：
1、洗涤不充分 解决办法：使用前需检查洗板机是否正常工作
2、洗板机管道堵塞 解决办法：需经常维护洗板机
3、加结合物是，洒在微孔边缘 解决办法：小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触
4、微孔中液体挥发 解决办法：用封板胶密封反应孔，置于湿盒内
边缘效应
可能原因：
1、孵育温度不均衡 解决办法：避免在环境温度变化大的地方
2、蒸发 解决办法：确保孵育是封闭完好
3、酶标板叠放 解决办法：避免酶标板叠放
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1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是双抗体夹心法及间接法。
ELISA样本的处理
ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划。
注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2。
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融。
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色。
5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存。
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深。
反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存。
ELISA的常见标本
液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等
培养细胞
组织标本
ELISA标本的保存
一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，
浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
测抗体的血清的标本如需保存作多次检测，以少量分装冰存，
保存血清只采集是就应注意无菌操作，也可加入适当的防腐剂，抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议劲量不使用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
ELISA标本的处理
1、血清：室温血液私人凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如有沉淀形成，应再次离心
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成分时，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清，检测细胞内的成分时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分。
5.组织标本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后任然保持2-8°C的温度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用，
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行试验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20°C保存，单应避免反复冻融。
ELISA的常见问题及解决方法
高背景或阴性对照只偏高
可能原因：
1、阴性对照孔被阳性对照货样品污染 解决办法：洗涤时，勿将洗液溢出孔外
2、抗体非特异性结合 解决办法：封闭液不合适，更换封闭液
3、酶结合物过浓 解决办法：请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
4、孵育温度过高 解决办法：检查孵育箱的温度是否正确、稳定
5、底物再使用前曝光 解决办法：应保存再暗处、避光
6、读板前停留时间过长 解决办法：加终止液后3分钟内读数
标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因：
1、样本中无检测物或检测无含量极低 解决办法：设置内参，重新实验
2、样本中其它物质影响/掩盖检测 解决办法：作适当稀释，降低其它物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率
3、样本中检测物浓度过高，HOOK效应导致假低值 解决办法：适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内
重复性较差
可能原因：
1、微孔中有气泡 解决办法：用针尖挑破气泡
2、试剂未混匀 解决办法：确保充分混匀试剂
3、样本中有杂质或沉淀物 解决办法：使用前，离心
4、微孔包被面被吸头划破 解决办法：加液时小心操作
5、使用过的封板胶纸 解决办法：每次须使用新的封板胶封住反应孔
假阳性反应
可能原因：
1、洗涤不充分 解决办法：使用前需检查洗板机是否正常工作
2、洗板机管道堵塞 解决办法：需经常维护洗板机
3、加结合物是，洒在微孔边缘 解决办法：小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触
4、微孔中液体挥发 解决办法：用封板胶密封反应孔，置于湿盒内
边缘效应
可能原因：
1、孵育温度不均衡 解决办法：避免在环境温度变化大的地方
2、蒸发 解决办法：确保孵育是封闭完好
3、酶标板叠放 解决办法：避免酶标板叠放
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