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甲基化检测

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分DNA甲基化通常能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而抑制基因表达,参与多种疾病包括各种肿瘤的发病机理,DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分DNA甲基化通常能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而抑制基因表达,参与多种疾病包括各种肿瘤的发病机理,DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

1)甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)

亚硫酸氢钠处理基因组DNA后,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;基于这种碱基的改变,根据甲基化位点设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR,通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。MSP法检测具备灵敏度高、快速、简捷等优点。

2)亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)

BSP甲基化测序通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,后在PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变,将PCR产物进行克隆测序,可以分析甲基化发生的具体情况。该方法实验结果准确性高,是甲基化检测的金标准。

 

3)高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)

高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)是近年来国外兴起的一种全新突变扫描和基因分型的遗传分析方法。亚硫酸氢盐处理后,甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异,这种差异可通过熔解曲线分析来发现,因为甲基化DNA含有更多的GC,相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化,可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技术可检出极微小的差别。使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物,相比以往的方法更加快捷、简便和精确。

实验流程

基因组DNA提取——DNA质检及定量——亚硫酸氢钠修饰——DNA修饰纯化后回收——引物设计——PCR扩增——甲基化修饰检测——数据分析。

样品要求

1)细胞样品:细胞数≥106;

2)组织样品:总量≥0.50;

3)血液样品:体积≥1mL;

4)基因组DNA样品:体积≥20μL,浓度≥50ng/μL。


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