发布时间：2023-10-27 浏览次数：
PCR技术原理、实验步骤和应用
一、实验目的
1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
二、实验原理
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、pcr技术应用
1)在传染病的诊断和研究中的应用
目前PCR在临床上应用广泛，其中前景最为广阔的是对传染病的诊断和研究。因为传染病的病原体无论是细菌，还是病毒或寄生虫，对于机体来说，就是一种外源入侵者，不论其致病是否由基因所致，只要病原体存在，机体内就会有其核酸存在，而且这种核酸顺序与人类基因组顺序往往不同，所以选择PCR技术进行诊断较细胞培养法、血清学方法更为简便、敏感和快速。在检测病毒方面，做得比较多的是对结核、麻风、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等以及对艾滋、人乳头状瘤病毒、人T细胞淋巴瘤病毒、EB病毒、肝炎病毒等的研究。以前AIDS病的诊断主要采用的是血清学的方法。虽然血清学试可以确定是否接触过HIV病毒，但它不能确定是否存在HIV感染。因为HIV感染者的外周血淋巴细胞中仅万分之一含有病毒RNA，所以采用体外培养来使HIV病毒繁殖，往往需要三到四周，而且不稳定。如果采用PCR技术来扩增HIV病毒的保守序列，再鉴定HIV病毒，则不仅使诊断的敏感度大大提高，而且时间也大大缩短。
2）PCR在遗传病的诊断和研究中的应用
遗传病是一大类严重危害人类健康、影响人口质量的疾病。有些遗传病在胎儿出生后有一定的治疗手段，这一类遗传病如早期发现，便可早期治疗，防止其并发症特别是不可逆性的后果发生。而另一类遗传病目前尚无有效疗法，就应在患儿出生前做产前诊断，确诊后进行人工流产或引产，以保证人口质量，减少家庭和和社会负担。
3）在肿瘤的诊断、研究及残留癌细胞中的应用
肿瘤的发生与演进是一个多阶段的过程，其中包括多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，一起上述改变的遗传学基础主要是点突变、重排、扩增和缺失等。PCR技术为检测这些ＤＮＡ异常提供了敏感、快速和特异方法，这不仅促进了肿瘤分子遗传学的发展，并为临床肿瘤学上的应用开创了新的条件。
抑癌基因（肿瘤抑制基因）是其正常产物可防止细胞癌变的一组基因，它们的功能可能与细胞分化和控制细胞增殖有关。当抑癌基因的一对等位基因均丧失功能（失活）时，最终可能导致肿瘤的发生。引起抑癌基因失活的DNA损伤主要是点突变和缺失等，因此可用点突变的检测技术进行检测。较大的基因缺失的检测可在显微镜下进行染色体分析，微小缺失则可采用印迹杂交技术来鉴定，目前采用PCR技术非常简捷，且不需要同位素标记探针，其关键在于引物设计，主要有两种方式：1若缺失DNA片段不大，一对引物分别与缺失片段两侧顺序互补，在有抗癌基因缺失的肿瘤中，PCR扩增的靶DNA片段减小；2若缺失DNA片段较大，一对引物设计在缺失片段中，这样在有抑癌基因缺失的肿瘤，则无靶DNA扩增的产物。