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WB技术具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。选用合适的内参抗体能够校正蛋白定量和上样过程中的误差,通过灰度计量可以定性或定量分析不同样品中蛋白表达情况。
WB大致可分为以下七步:
1. 制备样本
样品需要在蛋白裂解液中充分裂解,细胞或组织中的物质才能释放出来,去匀浆然后提取上清液,某一亚细胞组分蛋白的提取可以利用特定的蛋白裂解液,例如细胞膜蛋白裂解液。
常用的裂解成分大多包含TritonX-100、NP-40、SDS等,这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用,可将细胞膜或核膜裂解,释放其中的物质。
2. 蛋白定量
WB的目的是测量目的蛋白的表达情况,蛋白定量是指总蛋白一样,在总蛋白一样的情况下,才能体现出目标蛋白的差异。
目前,测量总蛋白浓度最常用的方法是BCA法,其原理是在碱性环境中,蛋白质将二价铜离子还原为一价铜离子,而一价铜离子能够与BCA试剂发生颜色反应,形成稳定的蓝紫色复合物,这种复合物具有很好的吸光性。在562nm的紫外光下,溶液中复合物的OD值在一定范围内成正比,因此能够获得样品中的蛋白浓度。
3. 蛋白电泳
常用的电泳胶是SDS-PAGE,在这一步蛋白会根据分子量的大小分开。
其原理是SDS带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷,因此消除了或掩盖了不同种类蛋白之间原有的电荷差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
4. 转膜
转膜是将蛋白从琼脂糖凝胶转移到膜上固定,因为蛋白在胶的内部,转移到膜上后在膜的表面,更容易与抗体结合。在一步中,需要制作一个“三明治”,胶放在负极一侧,膜放在正极一侧,在电流的作用下,带有负电的蛋白就会从胶上转移到膜上。
常用的转印膜主要有PVDF膜和NC膜(硝酸纤维素膜)。挑选转印膜时需关注膜的种类、孔径、结合蛋白的能力等,这些都会影响后续显色检测。
5. 封闭
由于膜具有与蛋白高度亲和的能力,为了避免作为检测探针的抗体与膜发生非特异性结合,使非特异背景提高,需要对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。不同的体系(抗原,抗体,检测体系)需要不同的封闭液,常用的封闭液有脱脂奶粉和BSA等。
6. 孵育抗体
在这一步中,一抗能够与蛋白结合,二抗是被标记了的抗体,一个一抗能够与多个二抗结结合,从而达到放大信号的作用,大大提高检测灵敏度。
7. 底物检测
常用的免疫印迹检测方法包括化学发光检测、荧光检测或显色检测。
由于灵敏度高且可通过胶片或数字成像系统灵活检测,化学发光成为了许多实验室进行免疫印迹实验的首选检测方法。